MAGNEZIJUM

Ukupna koliina magnezijuma u organizmu je oko 1 mol (20 - 28 g), od ega je vie od 95% smeteno intracelularno, tako da on, zajedno sa kalijumom predstavlja tipian intracelularni katjon. Najvie magnezijuma imaju elije skeletnih i sranih miia. Intracelularni magnezijum je kofaktor u oko 300 enzimskih reakcija, ukljuujui energetski metabolizam i sintezu proteina i nukleinskih kiselina, regulator je jonskih kanala, vaan je intracelularni signalni molekul i modulator oksidativne fosforilacije. U plazmi je oko 55% magnezijuma slobodno, 30% magnezijuma je vezano za proteine (uglavnom albumin) a ostatak od 15% se nalazi u obliku kompleksa sa fosfatima, citratima i ostalim anjonima. Ekstracelularni magnezijum uestvuje u formiranju nervnog impulsa, miinoj kontrakciji i transportu kalijuma i kalcijuma. Vie od polovine magnezijuma nalazi se u kostima (55%), zajedno sa kalcijumom i fosfatom, a ostatak je u mekim tkivima (jetri, bubrezima i miiima). Dve treine od ukupne koliine magnezijuma koja se nalazi u kostima ini vrsti skelet a jedna treina po potrebi moe da se mobilie i ona ustvari regulie normalnu koncentraciju magnezijuma u plazmi. Koncentracija magnezijuma u plazmi se odrava u vrlo uskim granicama, ali nije poznat mehanizam homeostaze. Sigurno je jedino da u tome ulogu imaju parathormon (verovatno slino kao to regulie metabolizam kalcijuma, odnosno poveava reapsorpciju magnezijuma u tubulima) i aldosteron (koji regulie izluivanje, slino kao i izluivanje kalijuma). Pregled metoda za odreivanje magnezijuma U metode za odreivanje koncentracije magnezijuma ubrajaju se precipitacione, kompleksometrijske, fluorimetrijske, spektrometrijske, plamena emisiona spektroskopija i atomska apsorpciona spektroskopija. Najstarije metode za odreivanje magnezijuma su precipitacione, kod kojih je magnezijum taloen u obliku soli, najee kao magnezijum-amonijum-fosfat, MgNH4PO4. Taloenje magnezijuma sa 8-hidroksihinolinom je princip na kome se zasniva vie metoda; 8-hidroksihinolin iz taloga je odreivan na razliite naine, uglavnom fotometrijski. Sve precipitacione metode danas imaju samo istorijski znaaj. Kompleksometrijske metode koje koriste EDTA i druge helatore takoe nisu nale iru primenu u praksi, kao i osetljiva fluorimetrijska odreivanja koja se zasnivaju na reakciji magnezijuma sa kalceinom, o,o'-dihidroksiazo-benzenom i 8-hidroksihinolinom. Takoe slabu primenu je imala i plamena emisiona spektroskopija zbog injenice da magnezijum emituje malu koliinu svetlosti na niim temperaturama, a i natrijum i kalijum dosta interferiraju pri ovom odreivanju. Danas se magnezijum uglavnom odreuje spektrometrijski sa razliitim bojama, koje se primenjuju direktno na bioloki materijal ili posle deproteinizacije. Jedna od takvih je titanuto (tiazol-uto, Clayton-ovo uto, 2,2'-(diazoimino-di-p-fenilen)-bis-(6-metil-7-benzotiazoldinatrijum-sulfonat)) sa kojim magnezijum u alkalnoj sredini daje crveno obojeno jedinjenje. Sama boja titan-uto je heterogena po svom sastavu, ali ima komponentu koja je vrlo reaktivna u odnosu na magnezijum i koja se adsorbuje na koloidne estice Mg(OH)2. Nedostatak ove metode je to crveno obojeni proizvod reakcije ima tendenciju da se taloi, a to se spreava dodatkom polivinil-alkohola, koji ga stabilizuje i istovremeno pojaava boju, jer sama reakcija nije naroito osetljiva. Skoro osam puta osetljivija metoda za odreivanje magnezijuma je metoda sa magonom (xylidyl blue, Mann Yoe boja, 1-azo-2-hidroksi-3-(2,4-dimetilkarboksianilido)-naftalen-1-(2-

hidroksibenzen)-5-natrijum-sulfonat) kod koje se u alkalnoj sredini i u alkoholnom rastvoru dobija crveno obojeni kompleks. Uticaj kalcijuma se eliminie dodatkom EDTA ili dimetil sulfoksida. Direktno odreivanje magnezijuma bez deproteinizacije mogue je u metodi sa kalmagitom (1-(1-hidroksi-4-metil-2-fenilazo)-2-naftol-4-sulfonska kiselina)) sa kojim se u alkalnoj sredini dobija ruiasto-ljubiasto obojeni kompleks. Uticaj kalcijuma se eliminie dodatkom EDTA, a proteini se odravaju u rastvoru sa polivinilpirolidonom. Reakcija je vrlo brza i adaptirana je za primenu na nekim automatskim analizatorima. U novije vreme su postavljene enzimske metode za odreivanje magnezijuma, kod kojih se u prisustvu fosforilirajuih enzima prenosi fosfatna grupa iz kompleksa Mg-ATP na neko jedinjenje. Originalna metoda predlae sistem reakcija u kome se glukoza prevodi u glukozo6-fosfat uz pomo heksokinaze (HK), a u indikatorskoj reakciji se na 340 nm meri porast apsorbancije stvorenog NADPH u reakciji koju katalizuje glukozo-6-fosfat-dehidrogenaza (G6-PDH):
glukoza +M g.ATP
H K +

glukoza - 6 - fosfat + M g.AD P +H+

glukoza - 6 - P + N P AD

G - 6-PDH 6 - fofoglukon olakton + N PH AD

Modifikacija ove metode se zasniva na sistemu enzimskih reakcija koje katalizuju glicerolkinaza, glicerofosfat-oksidaza i peroksidaza. Metoda izbora za odreivanje magnezijuma je atomska apsorpciona spektrometrija, koja se zasniva na principu da atom nekog elementa u neekscitiranom stanju apsorbuje svetlost iste talasne duine kao to je ona koju emituje element u ekscitiranom stanju. Svaki element ima svoju karakteristinu apsorpcionu ili rezonantnu liniju i ne postoje dva elementa koja imaju identine rezonantne linije. Karakteristina apsorpciona linija za magnezijum je kod 285,2 nm.

ODREDJIVANJE MAGNEZIJUMA SA MAGONOM (METODA SA KSILIDIL PLAVIM) Princip metode Magnezijum u baznoj sredini sa bojom ksilidil plavo (xylidyl blue) formira kompleksno jedinjenje crvene boje. Intenzitet nastale boje je proporcionalan koncentraciji magnezijuma. Reagensi 1. Kolor reagens GOOD pufer pH 11.2 Xylidyl blue Tenzidi Stabilizatori 2. Standard magnezijuma Materijal za analizu Kao uzorak se koristi nehemolizovan i nelipemian serum, cerebrospinalna tenost, urin i plazma. Izvoenje 2 1 mmol/L 100 mmol/L 0.12 mmol/L

U epruvete odmeriti (mL): A serum reagens 2 demineralizovana voda 0,01 St 0,01 SP 0.01

reagens 1 1,0 1,0 1,0 Izmeati, ostaviti da stoji 5 min i zatim izmeriti apsorbanciju analize (AA) i standarda (ASt) prema slepoj probi na 510 nm. Boja je postojana trideset minuta. Izraunavanje

magnezijum ,mmol L = /

AA 1 A St

Referentne vrednosti 0,65 do 1,15 mmol/L Napomene 1. Kako je sadraj magnezijuma u eritrocitima vei nego u plazmi potrebno je da se serum i plazma odvoje to je pre mogue, kao i da ne budu hemolizovani. Serum i plazma mogu da se uvaju nekoliko dana na 40C. 2. Kao uzorak je najbolje koristiti serum ili heparizovanu plazmu. Citrati, oksalati i EDTA se ne koriste kao antikoagulansi zbog mogunosti formiranja kompleksa sa magnezijumom. 3. Urin se pre rada zakiseli do pH 1,0 dodatkom hlorovodonine kiseline i dobro izmea. Interpretacija rezultata Nedostatak magnezijuma izaziva neuromuskularne poremeaje, sline onima koji se javljaju kod hipokalcemije, kao i poremeaje u sranom ritmu. U ovome nije vaan samo apsolutni sadraj magnezijuma, nego i odnos magnezijuma i kalcijuma: to je vii sadraj kalcijuma u odnosu na mgnezijum, to je vei rizik za pojavu poremeaja u sranom ritmu, a time i poremeaja u cirkulaciji. Zbog toga se magnezijum u serumu ili plazmi odreuje uvek sa kalcijumom. Koncentracija magnezijuma u serumu treba da se prati kod pacijenata koji su na dugotrajnoj terapiji diureticima, kod pacijenata na parenteralnoj ishrani, kao i kod pacijenata sa insuficijencijom bubrega. Druga indikacija za praenje magnezijuma u serumu je insulinska terapija kod dijabetinih koma, jer u tim situacijama u elije zajedno sa glukozom ulazi i magnezijum. Poremeaji u koncentraciji magnezijuma u serumu ispoljavaju se kao poviene i sniene vrednosti.

A. Poviene vrednosti magnezijuma

Poviene vrednosti magnezijuma u serumu oznaavaju se kao hipermagnezemija, a to su stanja u kojima su vrednosti magnezijuma vee od 1,15 mmol/L. Hipermagnezemija se retko javlja, a najei uzrok je dehidratacija, posebno kod male dece, a takoe se javlja kod akutne i hronine insuficijencije bubrega kada je brzina glomerularne filtracije manja od 20 mL/min. Kod dijabetine ketoacidoze, kao i kod Cushing-ovog sindroma postoji tendencija pomeranja vrednosti magnezijuma ka viim vrednostima. Vano je napomenuti da hipermagnezemija ima isti efekat na srani mii kao i hiperkalemija. Lekovi koji posle dugotrajne primene poveavaju vrednosti magnezijuma u serumu su litijum, acetilsalicilna kiselina, progesteron, diuretik triamteren, kao i antacidi, posebno oni koji sadre magnezijum. B. Sniene vrednosti magnezijuma Sniene vrednosti magnezijuma oznaavaju se kao hipomagnezemija, a to su stanja u kojima su vrednosti magnezijuma manje od 0,65 mmol/L. Hipomagnezemija nije retka pojava kod hospitalizovanih pacijenata, a inae nastaje razliitim mehanizmima. Hipomagnezemija zbog smanjenog unoenja ili smanjene intestinalne apsorpcije javlja se kod malapsorpcija svih vrsta, kao i kod poremeene apsorpcije zbog unoenja alkohola, zatim kod parenteralne ishrane bez dodatka magnezijuma i kod razliitih dijeta koje nisu dobro isplanirane. Treba naglasiti da se magnezijum slabo apsorbuje u intestinumu u prisustvu ivotinjskih masti. Hipomagnezemija zbog poveanog gubitka : - Iz gastrointestinalnog trakta kod dugotrajnih dijareja; - Putem bubrega zbog poremeene funkcije tubula, a u tim sluajevima se istovremeno javljaju i hipokalemija i hipokalcemija; - Posle tekih hirurkih zahvata, kao i posle tekih opekotina, to je praeno poremeajem u koncentraciji drugih elektrolita. Hipomagnezemija zbog poremeaja u endokrinoj regulaciji sree se u hipertireozi, kod hipoparatiroidizma, kao i u trudnoi. Hipomagnezemija zbog prelaska magnezijuma iz ekstracelularne u intracelularnu tenost nastaje posle operativnog uklanjanja tumora paratiroidnih ljezda, kao i u rehabilitacionoj fazi posle osteitisa (kada dolazi do prelaska magnezijuma iz ekstracelularne tenosti u kosti). Kod nekih pacijenata se razvija hipomagnezemija posle dugotrajne primene nekih diuretika (tiazida, etakrinske kiseline i furosemida), kao i posle primene gentamicina i kanamicina.

KALCIJUM
Kalcijum je ekstracelularni katjon koji zajedno sa fosfatom ini neorganski deo kostiju i dentina. Ukupna koliina kalcijuma u organizmu je priblino 25 mol (1 kg), od ega se samo 25 mmol nalazi u elijama. Od celokupne koliine ekstracelularnog kalcijuma skoro 99% je smeteno u kostima i zubima u obliku kompleksne soli hidroksiapatita. Na povrini kostiju postoji izmenljiva frakcija (oko 125 mmol) kalcijuma, koja po potrebi moe da pree u intersticijalnu tenost i predstavlja dinamiki "pool" kostnog rezervoara. Smatra se da ovaj kalcijum u obliku soli koje se lako mobiliu spreava promene koncentracije kalcijuma u ekstracelularnoj tenosti. U plazmi se kalcijum nalazi u tri fiziko-hemijska stanja: - vezan za proteine (40 - 45%) i to uglavnom za albumin, a oko 20% za globuline); vezivanje kalcijuma za proteine zavisi od pH i sa porastom pH raste koliina kalcijuma koja se vezuje za proteine. - vezan kompleksno (10 - 14%) sa malim difuzibilnim anjonima, kao to su citrat, laktat, fosfat i bikarbonat. - u jonskom obliku (oko 45%) koji predstavlja fizioloki aktivan oblik kalcijuma. Kompleksno vezan i jonizovani kalcijum ine difuzibilnu frakciju kalcijuma u plazmi. Funkcije kalcijuma su vrlo razliite. Iako mu je koncentracija u eliji vrlo niska, ima ulogu prvog neorganskog prenosioca poruka za regulaciju funkcije elije. On utie na aktivnost enzima, u prvom redu adenilat ciklaze i fosfodiesteraze na taj nain to se reverzibilno vezuje za jedan mali protein, kalmodulin. Takoe regulie propustljivost elijske membrane, izaziva oslobaanje neurotransmitera i smanjuje neuromuskularnu ekscitabilnost. Kalcijum izvan elija predstavlja izvor za intracelularni kalcijum, obezbeuje kalcijum za mineralizaciju kostiju, uestvuje u koagulaciji i obezbeuje potencijal plazma membrane. Sniene koncentracije ekstracelularnog kalcijuma poveavaju neuro-miinu ekscitabilnost a poviene imaju suprotno dejstvo. Sekrecija nekih endokrinih ljezda (paratiroidna, tiroidna, beta-elije pankreasa) regulisana je koncentracijom ekstracelularnog (jonizovanog) kalcijuma. Koncentraciju kalcijuma u organizmu reguliu tri hormona: parathormon. 1,25-dihidroksiholekalciferol (bioloki aktivan oblik vitamina D) i kalcitonin. Paratiroidni hormon deluje na nivou kostiju i na nivou bubrega, poveavajui koncentraciju kalcijuma u ekstracelularnoj tenosti. Takoe, 1,25-dihidroksi-holekalciferol na nivou gastrointestinalnog trakta i bubrega stimulie reapsorpciju kalcijuma i poveava njegovu koncentaciju u plazmi. Kalcitonin na nivou kostiju i bubrega deluje tako to smanjuje koncentraciju kalcijuma u plazmi. Na koncentraciju ukupnog kalcijuma (ali ne i difuzibilne frakcije) u plazmi utie i koncentracija proteina u plazmi, poto je skoro polovina kalcijuma vezana za proteine. Pored toga, svaka promena u koncentraciji fosfata, izazvae promenu u koncentraciji kalcijuma, obzirom da su ova dva jona u recipronom odnosu.

A. Metode za odreivanje ukupnog kalcijuma

Metodama za odreivanje koncentracije ukupnog kalcijuma odreuje se slobodan (jonizovani) kalcijum, kalcijum vezan za proteine plazme i kalcijum kompleksno vezan sa malim difuzibilnim anjonima. Iako se smatra da je jonizovani kalcijum mnogo bolji pokazatelj statusa kalcijuma u organizmu odreivanje koncentracije ukupnog kalcijuma u serumu se jo uvek iroko koristi u laboratorijama. 5

Najstarija metoda za odreivanje ukupnog kalcijuma, a dugo godina i referentna za kalcijum, zasnivala se na taloenju kalcijuma sa oksalnom kiselinom, iza ega je sledila redoks titracija sa kalijum permanganatom ili cerijum sulfatom. Ove su metode bile dugotrajne, reagensi nestabilni i 50-tih godina su zamenjene kompleksometrijskim. Kompleksometrijske metode se zasnivaju na stvaranju helata izmeu kompleksona (aminopolikarbonskih kiselina) i metala u prisustvu razliitih indikatora, pri emu su helati izmeu kompleksona i metalnih jona stabilniji od helata izmeu indikatora i tih jona, pa komplekson vezujui metalni jon oslobaa indikator, to dovodi do promene boje reakcione smee. Najcee korieni komplekson je etilen-diamino-tetrasiretna kiselina (EDTA), koja u jako alkalnoj sredini disosuje kao anjon, a kao indikatori se koriste mureksid (amonijum purpurat), eriohrom crno T (dinatrijumova so 2,2-dioksiazonaftalina) i kalcein (4metilumbeliferon-6-metilen-iminidisiretna kiselina). Mureksid je specifian indikator za kalcijum (vezuje ovaj jon u odnosu 1:1) i daje mogunost direktnog odreivanja kalcijuma, jer drugi metali ne interferiraju. Boja mureksida zavisi od pH i u jako alkalnoj sredini od svetlo ljubiaste boje, koju ima u slobodnom obliku, prelazi u crveno ruiasti kompleks sa kalcijumom, ali prelaz boje nije naroito otar. Eriohrom crno T ima otriji prelaz boje i u jako alkalnoj sredini menja boju od plave u slobodnom obliku do crvene u kompleksu sa metalom. Nedostatak ovog indikatora je to sa njim reaguju i kalcijum i magnezijum, tako da krajnji rezultat predstavlja sumu ova dva jona, pa ih je potrebno razdvojiti, najee taloenjem kalcijuma sa oksalatom. Od kompleksometrijskih metoda danas primenu uglavnom ima metoda sa kalceinom, kod koje se kalcijum iz fluorescirajueg kompleksa sa kalceinom (fluorescira na 520 nm, uz ekscitiranje na 490 nm) istiskuje sa kompleksonom, a to izaziva gaenje fluorescencije i promenu boje. Kao komplekson koristi se etilenglikol-diaminoetiletar-tetrasiretna kiselina (EGTA). Kod prvih kolorimetrijskih metoda kalcijum je taloen sa hloranilinskom kiselinom, talog rastvaran u alkalnom rastvoru EDTA, a crveno-ljubiasta boja osloboene hloranilinske kiseline merena na 520 nm. Kalcijum moe da se taloi i sa naftilhidroksaminskom kiselinom, talog se takoe rastvori u alkalnom EDTA i meri intenzitet narandasto-crvene boje koja nastaje posle dodatka feri nitrata. Ove precipitacione metode danas imaju samo istorijski znaaj. Direktne spektrometrijske metode za odreivanje kalcijuma zasnivaju se na obrazovanju obojenih kompleksa izmeu kalcijuma i razliitih organskih molekula, kao to su alizarin, arsenazo III, o-krezolftalein komplekson i metiltimol plavo. Metoda sa o-krezolftaleinom se najvie koristi i kod nje se na 570 nm meri intenzitet ljubiaste boje nastalog kompleksa, a interferencija magnezijuma se eliminie dodatkom 8hidroksihinolina. Takoe, interferencija magnezijuma moe se otkloniti i poveanjem pH sredine za izvoenje reakcije (pH 12) . Dodavanje kalijum cijanida stabilizuje kompleks i eliminie interferencije koje potiu od tekih metala. Da bi se obezbedio konstantan pH koriste se kao pufer 2-etilaminoetanol ili 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP). Reakcija je osetljiva i na promenu temperature. U skorije vreme sve veu upotrebu ima metoda za odreivanje kalcijuma spektrofotometrijski sa arsenazo III (1,8-dihidroksinaftalen-3,6-disulfonska kiselina-2,7bis[azo-2] fenilarsonska kiselina). Arsenazo III ima veliki afinitet za kalcijum. Metoda se najee izvodi pri pH 6, jer na ovoj pH vrednosti boja ima mnogo vei afinitet prema kalcijumu nego prema magnezijumu. U ovoj metodi citrati mogu negativno da interferiraju, pa se citratna plazma ne koristi kao uzorak. Uticaj ostalih interferirajuih supstanci se uklanja merenjem apsorbancije kompleksa na 650nm.

Emisiona plamena spektrometrija moe da se koristi i za odreivanje kalcijuma, ali metoda ima lou osetljivost, jer natrijum i kalijum daju pozitivnu interferenciju, a fosfat inhibira emisiju. Interferencije mogu da se smanje prethodnim izolovanjem kalcijuma kao oksalata, a osetljivost se poveava dodatkom nekog organskog rastvaraa. Metoda izbora za odreivanje kalcijuma je atomska apsorpciona spektrometrija koja ima sledee prednosti: visoku specifinost, nema interferencije drugih metala, priprema uzoraka ukljuuje najee samo razblaivanje biolokog materijala, donja granica osetljivosti je vrlo niska, pa se za rad koriste vrlo male zapremine uzorka i na kraju, za samo izvoenje metode potrebno je vrlo malo vremena. Karakteristina apsorpciona linija za kalcijum je na 422,7 nm. B. Metode za odreivanje jonizovanog kalcijuma Odreivanje jonske frakcije, odnosno fizioloki aktivnog oblika kalcijuma izvodi se merenjem razlike u elektrohemijskom potencijalu izmeu kalcijum jon-selektivne elektrode i referentne elektrode, kada su obe uronjene u uzorak koji sadri kalcijum. Za ovu svrhu na raspolaganju su analitiki sistemi razliitih proizvoaa, a svi oni pored kalcijum jonselektivne i referentne (Ag/AgCl ili Hg/Hg2) elektrode sadre i pumpu za uzimanje uzorka, potenciometar i elektronsku jedinicu za izraunavanje i prikazivanje rezultata. Razlikuju se izmeu sebe po koliini uzorka koju zahtevaju, kao i prema vremenu koje im je potrebno za rad. Kalcijum jon-selektivna elektroda sadri tean ili vrst, naelektrisan ili neutralan jonski izmenjiva, tako modifikovan da selektivno reaguje sa kalcijumovim jonima. Meutim, selektivnost u odnosu na kalcijum nije potpuna, pa neki drugi katjoni (vodonik, magnezijum) mogu da daju pozitivnu interferenciju. Fizioloki anjoni (fosfat, citrat, laktat, okasalat i sulfat) obrazuju sa kalcijumom nejonizovana jedinjenja, pa time utiu na koncentraciju jonizovanog kalcijuma, mada sami ne reaguju sa jon-selektivnom elektrodom. Zbog ovih osobina citrat i oksalat ne mogu da se koriste kao antikoagulansi za uzorke u kojima treba odreivati jonizovani kalcijum, a to isto vai i za EDTA, koji gradi helat sa kalcijumom. Ranije je jonizovani kalcijum odreivan merenjem nivoa kalcijuma pre i posle tretiranja sa dekstran-gelom, ili pre i posle ultracentrifugiranja, odnosno ultrafiltracije. Priblina koncentracija jonske frakcije moe da se izrauna i iz izraza koji se zasniva na odnosu kalcijuma i proteina u serumu pri pH 7,35 i temperaturi od 25o C :

(24 x Ca uk u mmol/L) - (1/30 proteiniu serumuu g/L) mmol Ca jon = 0,4 (proteiniu seumu u g/L)
Ovaj izraz ne uzima u obzir da kalcijum ima razliit afinitet za vezivanje sa pojedinim proteinima, kao i da na rezultate utie svaka promena pH plazme.

ODREDJIVANJE KALCIJUMA SA ARSENAZO III Princip metode Kalcijum gradi kompleksno jedinjenje sa arsenazo III ligandom sa maksimumom apsorbance na 650 nm. Intenzitet boje nastalog kompleksa proporcionalan je koncentraciji kalcijuma u uzorku. Reagensi 2. Kolor reagens

PIPES pufer pH 6,8 Arsenazo Stabilizatori 2. Standard kalcijuma Materijal za analizu

50 mmol/L 350 mol/L 2,5 mmol/L

Kao uzorak se koristi serum, plazma (kao antikoagulans se koristi iskljuivo heparin) ili urin. Izvoenje U epruvete odmeriti (mL): A serum reagens 2 demineralizovana voda 0,01 St 0,01 SP 0.01

reagens 1 1,0 1,0 1,0 Izmeati, ostaviti da stoji 2 min i zatim izmeriti apsorbanciju anlize (AA) i standarda (ASt) prema slepoj probi na 650 nm. Boja je postojana trideset minuta. Izraunavanje

kalcijum ,mmol/ L =

AA 2,5 A St

Referentne vrednosti 2,16 do 2,60 mmol/L Napomene 1. Urin se sakuplja u bocu koja je isprana kiselinom i sadri 5 mL HCl, 6 mol/L. Ako se urin sakuplja bez dodatka kiseline, pre rada je potrebno da se pH dotera na vrednost 3-4 dodavanjem HCl, 6 mol/L, s tim to zapremina dodate kiseline ne treba da bude vea od 10 mL. 2. Bioloki materijal je stabilan vie nedelja ako se uva na 4o C. Do smanjenja vrednosti kalcijuma moe da doe zbog vezivanja kalcijuma za staklo ili zid polietilenskog suda, ili zbog vezivanja kalcijuma sa fibrinom, ako je u pitanju plazma. Interpretacija rezultata Odreivanje kalcijuma je od znaaja za dijagnozu i terapijsku kontrolu mnogih bolesti. A. Poviene vrednosti kalcijuma Poviene vrednosti kalcijuma u serumu oznaavaju se kao hiperkalcemija, a predstavljaju stanja kod kojih su koncentracije kalcijuma vee od 2,55 mmol/L. Nisu uvek poznati mehanizmi koji dovode do hiperkalcemije, ali bi mogli da se sistematizuju na sledei nain:

Hiperkalcemija zbog prekomernog unoenja kalcijuma Unoenje soli kalcijuma u vidu razliitih namirnica ne dovodi do hiperkalcemije, ali kada se unose velike koliine (vie od 5 g/dan) u obliku antacida uz velike koliine mleka moe doi do hiperkalcemije sa svim simptomima koji je prate (mleno-alkalni-sindrom) U tom sluaju postoji i blaga hiperfosfatemija i blaga alkaloza, a aktivnost alkalne fosfataze je normalna. Hiperkalcemija zbog prekomerne mobilizacije kalcijuma iz kostiju Zbog osteoklastinog delovanja neoplazmi dolazi do hiperkalcemije i to posebno kod sledeih tumora: - Karcinom dojke sa metastazama na kostima (hiperkalcemija nije u korelaciji sa obimom destrukcije kostiju); - Karcinom bronhija sa metastazama na kostima; - Akutne mijeloidne i limfatine leukoze, mijelofibroze i mijelomi. Do poveane mobilizacije kalcijuma iz kostiju dolazi i u sluajevima imobilizacije svih vrsta. Hiperkalcemija zbog poremeaja u endokrinoj regulaciji 1. Primarni hiperparatiroidizam (multipli adenom, hiperplazija, karcinom) je najei uzrok hiperkalcemije, a to je praeno hipofosfatemijom ili koncentracijom fosfata na donjoj granici, kao i poveanim koncentracijama hlorida. 2. Sekundarni hiperparatiroidizam do koga dovode sve bolesti koje sniavaju jonizovani kalcijum u serumu. U poetnoj fazi insuficijencije bubrega esto dolazi do hipokalcemije zbog nedostatka 1,25-dihidroksi-holekalciferola, a hipokalcemija izaziva (zbog mehanizma povratne sprege) hiperparatiroidizam, to za posledicu ima pojaanu mobilizaciju kalcijuma iz kostiju i hiperkalcemiju. 3. Druge endokrine bolesti koje mogu da dovedu do hiperkalcemiju su hipertireoza i Adisonova bolest. Hiperkalcemija zbog renalne disfunkcije U diuretinoj fazi posle akutnih zastoja bubrega, kao i posle transplantacije bubrega dolazi do sekundarnog hiperparatiroidizma. B. Sniene vrednosti kalcijuma Sniene vrednosti kalcijuma u serumu oznaavaju se kao hipokalcemija a to su stanja kod kojih su koncentracije kalcijuma u serumu manje od 2,1 mmol/L. Mehanizmi koji dovode do hipokalcemije mogu da se klasifikuju na sledei nain: Hipokalcemija zbog smanjenog unosa i/ili poveanog utroka kalcijuma 1. U toku trudnoe se smanjuju vrednosti kalcijuma za oko 10%, a mogu da dou i na donju granicu referentnih vrednosti. 2. Kod malapsorpcija svih vrsta moe tako da bude smanjena apsorpcija kalcijuma da to dovede do hipokalcemije. Ako se taj poremeaj desi u ranim godinama ivota, posledica moe da bude rahitis. Hipokalcemija zbog tekih disproteinemija/hipoalbuminemija Kada u toku teke ciroze jetre ili nefrotskog sindroma doe do pojave hipoalbuminemije, kao posledica se javlja smanjena koncentracija ukupnog kalcijuma u serumu. Meutim, kod

ovih pacijenata se ne smanjuje koncentracija jonizovanog kalcijuma, tako da nema karakteristinih simptoma hipokalcemije. Hipokalcemija zbog poremeene endokrine regulacije Hipoparatiroidizam je najei uzrok za pojavu hipokalcemije, a javlja se esto posle operativnih zahvata na tiroidnoj ili paratiroidnim ljezdama, kao i drugih zahvata na prednjem delu vrata. Hipoparatiroidizam moe biti i funkcionalni, kada je luenje parathormona smanjeno zbog digotrajnog nedostatka magnezijuma, jer je magnezijum neophodan za sekreciju parathormona.

10

NEORGANSKI FOSFAT
U organizmu se nalazi oko 20 mol (620 g) fosfora, najveim delom u obliku fosfata, koji je rasporeen ravnomerno izmeu ekstra- i intracelularnog prostora, za razliku od kalcijuma koji je lokalizovan uglavnom ekstracelularno. U elijama se fosfor nalazi najvie kao organski ili estarski vezan u obliku fosfolipida, fosfoproteina, glicerofosfata, heksoza fosfata, nukleotid fosfata itd. Koncentracija fosfora u eliji je vrlo niska, ali i pored toga ima znaajnu ulogu: u obliku fosfolipida predstavlja strukturnu komponentu elijske membrane, u obliku nulkleotid fosfata uestvuje u energetskom metabolizmu, predstavlja supstrat za oksidativnu fosforilaciju, uestvuje u procesima u kojima se stvara ATP itd. Najvei deo ekstracelularnog fosfata (oko 87%) prisutan je u kostima u obliku soli hidroksiapatita, a u plazmi ga ima najvie neorganski vezanog u obliku jona H2PO4- i HPO42(55%). Oko 10% fosfata u plazmi je vezano za proteine a 35% je kompleksno vezano sa magnezijumom, kalcijumom i natrijumom. Odnos neorganskog monovalentnog i dvovalentnog jona u plazmi zavisi od pH: pri pH 7,4 iznosi 1:4, u acidozi su koncentracije jednake, a u alkalozi idu do 1:9. U urinu taj odnos se kree od 1:100 pri pH 4,5 do 9:1 pri pH 8, i tu igra vanu ulogu u acido-baznoj ravnotei. Koncentracija fosfata u plazmi rezultat je ravnotee izmeu apsorpcije u intestinumu, ekskrecije putem urina i fecesa i preraspodele izmeu ekstracelularne tenosti, elija i vrstih tkiva. Kao i kod kalcijuma, nivo fosfata reguliu parathormon, kalcitonin i vitamin D3 (1,25dihidroksi-holekalciferol), pri emu je naroito znaajan inhibitorni efekat parathormona na reapsorpciju u tubulima. Pregled metoda za odreivanje neorganskog fosfata Jo polovinom 19-og veka opisana je reakcija u kojoj fosfatni jon reaguje sa amonijum molibdatom, pri emu nastaje amonijum fosfomolibdat, (NH4)3(PO4(MoO3)12), kompleksno jedinjenje ute boje. Redukcijom ovog jedinjenja nastaje molibdensko plavo, jedan kompleksni heteropolimer nepoznate i verovatno heterogene strukture, ija se apsorbancija meri na talasnoj duini od oko 660 nm. Na ovom principu su zasnovane najstarije metode za odreivanje fosfata. Kao redukciona sredstva mogu da se koriste razliita jedinjenja, koja uglavnom imaju razliite nedostatke. Jedno od takvih je hidrohinon, iji je nedostatak to sporo deluje, boja nije naroito intenzivna, a sam intenzitet reakcije zavisi od temperature i kiselosti sredine. Neto bolji redukcioni agens je 1-amino-2-naftol-4-sulfonska kiselina (ANS), jer moe da se koristi na sobnoj temperaturi, ali je sama relativno nestabilna. Mnogo intenzivniju boju od one koja se dobija sa ANS daje stano-hlorid. Nedostatak ove metode je to je boja takoe nestabilna i osetljiva na male promene u koncentraciji kiseline, a i sam reagens je takoe nestabilan, mada je u nekim metodama stabilizovan dodatkom hidrazin sulfata. Kao redukciona jedinjenja mogu da se koriste jo i askorbinska kiselina, fero amonijum sulfat, p-metil-aminofenolsulfat i N-fenil-p-fenilendiamin. U nekim metodama koje se zasnivaju na formiranju amonijum-fosfomolibdata, fosfat se odreuje bez redukcije. Ako se molibdat u viku dodaje u kiseli rastvor vanadata i fosfata dobija se stabilno kompleksno heteropoli jedinjenje molibdo-vanadofosfat, (NH4)3PO4 x NH4VO3 x 16MoO3, ija se uto-narandasta boja moe da meri spektrometrijski. Nedostatak ove metode je to u slabo kiseloj sredini slepa proba ima visoku apsorbanciju, a u jako kiseloj sredini dolazi do hidrolize labilnih fosfatnih estara, pa se dobijaju vie vrednosti za fosfat.

11

Neredukovani amonijum fosfomolibdat moe da se meri i spektrometrijski na 340 nm, a metoda ima dobru tanost, preciznost i osetljivost, mada na rezultate mogu da utiu hemoliza i lipemija. Odreivanje fosfata na osnovu reakcije amonijum-fosfomolibdata sa razliitim baznim bojama je princip na kome se zasniva vei broj metoda. Jedna od takvih je metoda sa trifenilmetanskom bojom malahit-zeleno, koja je 30-puta osetljivija od redukcionih postupaka, a zasniva se na promeni maksimuma apsorbancije nastalog kompleksa u odnosu na maksimum apsorbancije same boje. Umesto malahit zelenog mogu da se koriste brilijant zeleno i rodamin B. Za odreivanje fosfata primenjuju se takoe i razliite enzimske metode, koje su specifine i osetljive, ali zbog tekoa u pripremanju reagensa (kontaminacija fosforom) jo uvek nisu nale iroku primenu. Prva od takvih metoda zasnivala sa na sistemu reakcija koje su katalizovali enzimi glikogen-fosforilaza (GF), fosfoglukomutaza (FGM) i glukozo-6-fosfatdehidrogenaza (G-6-PDH), a koliina fosfata je bila proporcionalna stvorenom NADPH, koji se meri na 340 nm:
HPO 4
2GF + glikogen glukoza - 1- P FGM glukoza - 6 - P G - 6 - PDH + NADP + 6 - fosfoglukonat + NADPH + H+

glukoza - 1- P glukoza - 6 - P

Drugi sistem enzimskih reakcija za odreivanje fosfata zasniva se na etiri enzimske reakcije, koje katalizuju gliceraldehid-fosfat-dehidrogenaza (GAPDH), fosfoglicerat-kinaza (FGK), heksokinaza (HK) i na kraju glukozo-6-fosfat-dehidrogenaza (G-6-PDH), a stvorena koliina NADPH u poslednjoj reakciji proporcionalna je koliini fosfata:
H PO
2 4

+ gliceralde hid 3 P + N D A
FG K

G D AP H

13 difosfogli cerat + N D , A H 13 difosfogli cerat + A P , D ATP + glukoza

H K

+ H+ + AD P + H+

3 fosfoglice rat + ATP

+

glukozo 6 fosfat
G 6 PD H

glukoza 6 fosfat + N P AD

6 fosfogluko nat + N D A PH

U novije vreme predloena je enzimska metoda za odreivanje fosfata u kojoj se koriste enzimi purin nukleozid fosforilaza (PNF), ksantin oksidaza (KsOD) i peroksidaza (POD), koja katalizuje reakciju izmeu nastalog peroksida i hromogena N-etil-N-(3-metilfenil)-Nacetiletilendiamina. Kao krajnji proizvod nastaje crveno-ljubiasti kompleks, ija se apsorbancija meri na 555 nm:
2HPO 4 + inozin PNF hipoksantin + ribozo - 1- P KsOD

hipoksantin + 2 H2O + 2 O 2 H2O 2 + hromogen

POD

mokrana kiselina + H2O 2

H2O + obojeni kompleks

ODREDJIVANJE NEORGANSKOG FOSFATA METODOM SA AMONIJUM-MOLIBDATOM

12

Princip metode Neorganski fosfat iz seruma (u obliku mono- i dihidrogen-natrijum-fosfata) reaguje sa amonijum-molibdatom u kiseloj sredini, pri emu nastaje kompleksno jedinjenje ute boje amonijum-fosfomolibdat (amonijum-dodekamolibdato-fosfat:
H2PO + 3 NH + + 12 MoO 2 + 22 H+ (NH 4 )3 [PO 4 (MoO 3 )12 ] + 12 H2O 4 4 4 HPO + 3 NH + + 12 MoO 2 + 23 H+ (NH 4 )3 [PO 4 (MoO 3 )12 ] + 12 H2O 4 4 4

Nastalo kompleksno jedinjenje ima bruto formulu (NH4)3[P(Mo3O10)4] kao i jedinjenje koje se izdvaja kao uti kristalni talog u reakciji za dokazivanje fosfatnog anjona. Do izdvajanja taloga dolazi kada se amonijum-molibdat doda u velikom viku uz zagrevanje. U uslovima u kojima se odigrava reakcija koja slui za odreivanje koncentracije neorganskog fosfata u humanom materijalu (koncentracija reagensa, temperatura, pH sredine) ne dolazi do izdvajanja taloga. Reagensi 3. Molibdatni reagens Amonijum molibdat Sumporna kiselina Deterdenti Stabilizatori 2. Standard fosfata Materijal za analizu Kao uzorak se koristi nehemolizovan i nelipemian serum, EDTA plazma ili urin Izvoenje U epruvete odmeriti (mL): A serum reagens 2 demineralizovana voda 0,02 St 0,02 SP 0.02 1 mmol/L 0,90 mmol/L 280 mmol/L

reagens 1 1,0 1,0 1,0 Izmeati, ostaviti da stoji 3 min i zatim izmeriti apsorbanciju anlize (AA) i standarda (ASt) prema slepoj probi na 340 nm. Boja je postojana trideset minuta. Izraunavanje

neorganskifosfatmmol L = , /

AA 1 A St

Referentne vrednosti Serum: deca: 1,0 - 2,0 mmol/L

13

odrasli:

0,8 - 1,6 mmol/L mukarci 0,7 - 1,2 mmol/L, ene 0,9 - 1,3 mmol/L

odrasli preko 70 g: Urin: odrasli:

13,0 - 42,0 mmol/dan

deca: 0,3 - 0,7 mmol/kg/dan Napomene 1. Za dobijanje plazme ne bi trebalo da se koriste uobiajeni antikoagulansi kao sto su oksalat, citrat ili EDTA, jer mogu da interferiraju u formiranju fosfomolibdata. 2. Serum i plazma treba da se odvoje od eritrocita najkasnije jedan sat po uzimanju krvi, a mogu da se uvaju nekoliko dana na 4oC, ili nekoliko meseci na 25oC. 3. Uzorci koji su hemolizovani ne smeju da se koriste, jer je u eritrocitima sadraj fosfora sedam puta vei nego u serumu, a pored toga i hemoglobin interferira sa bojenom reakcijom. 4. Krv se uzima od pacijenata posle nonog gladovanja jer se posle unoenja hrane sadraj fosfata sniava iz dva razloga: a) kod deponovanja glikogena u jetri i miiima smanjuje se sadraj fosfata zbog obrazovanja glukozo-fosfatnih intermedijera i b) posle obroka se poveava pH to pogoduje obrazovanju kompleksa izmeu kalcijuma i fosfata i njegovo deponovanje u kostima. 5. Poeljno je da se krv uzima bez podveske, jer venska staza izaziva hemokoncentraciju (zbog izlaska vode iz krvnih sudova) sa dodatnim efektom hipoksije, koja poveava razlaganje fosfatnih estara. 6. Urin u kome se odreuje fosfat sakuplja se u sudu koji je bez tragova deterdenata i opran kiselinom. Ako je urin alkalan moe da doe do taloenja fosfata i treba mu pre rada dodati kiselinu do pH 6. 7. Sadraj fosfata u urinu je vei nego u serumu i urin se razblauje u odnosu 1:10 do 1:20 ako je koncentrovaniji, odnosno 1:5 ako je razblaeniji. 8. Treba izbegavati pranje staklenog pribora deterdentima, jer svi sadre fosfate. Preporuuje se korienje plastinih epruveta za jednokratnu upotrebu, ili pranje pribora razblaenom azotnom kiselinom (l mol/L) i potom ispiranje obinom i demineralizovanom vodom. Interpretacija rezultata Metabolizmi kalcijuma i neorganskog fosfata su povezani, pa poremeaji u regulaciji jednog od ova dva jona izazivaju poremeaje u regulaciji drugog. Stoga je ispravno da se sa neorganskim fosfatom odreuje i kalcijum iz istog uzorka. Poremeaji u koncentraciji neorgnaskog fosfata u serumu ispoljavaju se kao poviene i sniene vrednosti. A. Poviene vrednosti neorganskog fosfata u serumu Poviene vrednosti neorganskog fosfata u serumu oznaavaju se kao hiperfosfatemija, a to su stanja u kojima je koncentracija neorganskog fosfata vea od 1,45 mmol/L. Hiperfosfatemija zbog prekomernog unosa fosfata sree se kod osoba koje unose velike koliine mleka (tzv. mleno-alkalni sindrom), to je praeno I hiperkalcemijom, kao I alkalozom I azotemijom. Hiperfosfatemija zbog prekomerne mobilizacije fosfata iz kostiju javlja se kod metastaza na kostima, multiplog mijeloma, leukoza, u toku hemoterapije.

14

Hiperfosfatemija zbog poremeaja u endokrinoj regulaciji javlja se u sledeim sluajevima: - Hipoparatiroidizam i pseudohipoparatiroidizam dovode do usporene sekrecije fosfata iz distalnih tubulocita, uz istovremenu normalnu reapsorpciju fosfata u proksimalnim tubulima; hiperfosfatemija je karakteristina pojava kod hipoparatiroidizma. - Kod prekomernog unoenja ili intoksikacije vitaminom D. - Kod akromegalije I Adisonove bolesti. Hiperfosfatemija kod smanjenog renalnog izluivanja sree se kod insuficijencije glomerula jer tada dolazi do zadravanja fosfata, to je u korelaciji sa brzinom glomerularne filtracije. Hiperfofatemija zbog delovanja lekova: diuretici furosemid I hidrohlortiazid, anaboliki steroidi, androgeni, progesteron, fenitoin I tetraciklini poveavaju koncentraciju fosfata u plazmi. B. Sniene vrednosti neorganskog fosfata Sniene vrednosti fosfata u plazmi oznaavaju se kao hipofosfatemija, a to su stanja u kojima je koncentracija neorganskog fosfata manja od 0,87 mmol/L. Hipofosfatemija je obino praena smanjenjem ukupne koliine fosfata u organizmu, ako je posledica poremeene apsorpcije u digestivnom traktu ili primarnog hiperparatiroidizma. Meutim, kod hipofosfatemije mogu da budu prisutne I normalne ili ak poviene rezerve fosfata, to je posledica prelaska fosfata iz ekstracelularne u intracelularnu tenost, posebno u miiima, masnom tkivu i jetri. Uzroci za ovakvu preraspodelu fosfata su alkaloza ili promena u metabolizmu ugljenih hidrata (kod davanja infuzionog rastvora sa glukozom ili kod hiperalimentacije). Hipofosfatemija zbog smanjenog unosa ili poremeene apsorpcije fosfata javlja se u sledeim sluajevima: - Kod malapsorpcija svih vrsta, ukljuujui i stanja posle gastrektomije kao i bolesti pankreasa; - Deficit vitamina D3; - Stanja gladovanja, kao i stanja hiperalimentacije (kada se unose velike koliine hrane ali bez dovoljno fosfata, to je sluaj kod bolnikih pacijenata u stanju rekonvalescencije); - Akutni i hronini alkoholizam su jedan od najeih uzroka hipofosfatemije. Hipofosfatemija zbog poremeene endokrine hiperparatiroidizma zajedno sa hiperkalcemijom. regulacije javlja se kod

Hipofosfatemija zbog renalne disfunkcije sree se u sledeim sluajevima: - Distalna (RTA I) i proksimalna (RTA II) renalna tubularna acidoza dovode do gubitka fosfata; - Kod pacijenata sa nefrolitijazom, posle transplantacije bubrega, kao i kod pacijenata na hemodijalizi esto dolazi do masivnog gubitka fosfata; - Kod osmotske diureze (npr. u diabetes mellitus-u); - Kod Fanconi sindroma (defekt proksimalnih tubula) se pored fosfata gube i glukoza, aminokiseline, bikarbonati i mokrana kiselina. Hipofosfatemija zbog prelaska fosfata iz ekstracelularne u intracelularnu tenost javlja se u sledeim stanjima:

15

- Kod dijabetine ketoacidoze (ree u drugim metabolikim acidozama), kao i kod respiratorne acidoze; - Posle tekih opekotina kada su ogoljene velike povrine koe; - Kod septikemija izazvanih gram-negtaivnim bakterijama. Hipofosfatemija zbog delovanja lekova: - Ovde su naroito vani antacidi koji vezuju jone fosfata, kao to su oni koji sadre magnezijum ili aluminijum-hidroksid; - Dugotrajna terapija sa acetacolamidom i hidrohlortiazidom kod mnogih pacijenata dovodi do hipofosfatemije; - Ostali lekovi koji sniavaja koncentraciju fosfata su oralni kontraceptivi, antikonvulzivi, estrogeni i insulin.

16